一代測(cè)序原理

Frederick Sanger 是一位1918年出生于美國(guó)的生物化學(xué)家，曾經(jīng)兩度獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 。上世紀(jì)70年代末，他提出快速測(cè)定脫氧核糖核酸（DNA）序列的技術(shù)“雙脫氧終止法”，也被稱(chēng)作“Sanger法”。

早在2001年完成的人類(lèi)基因組框圖，采用的就是該方法。而且因準(zhǔn)確率高，直到今天還在廣泛使用，也被稱(chēng)為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。下面我們來(lái)看看Sanger法是怎樣測(cè)得基因序列的。

Sanger 測(cè)序法原理

構(gòu)建反應(yīng)系統(tǒng)

Sanger法測(cè)序由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)包含

• 四種脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，可以正常合成DNA

• 每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)加入四種不同的雙脫氧核苷三磷酸 (ddNTP)，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，另外為了方便定位，需要用熒光或者同位素標(biāo)記。

• 目標(biāo)片段、DNA聚合酶、引物，反應(yīng)體系

這樣我們的四個(gè)反應(yīng)體系構(gòu)建完成 (四種顏色分別代表不同的 ddNTP 反應(yīng)體系)：

擴(kuò)增目的片段

下一步進(jìn)行擴(kuò)增，以目的片段為模板，在DNA聚合酶的催化下，從引物處起始開(kāi)始復(fù)制DNA，當(dāng)遇到ddNTP，反應(yīng)停止。

由于反應(yīng)體系中 dNTP 與 ddNTP 相對(duì)濃度的調(diào)節(jié)，使反應(yīng)擴(kuò)增得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。這里是ddNTP與dNTP在復(fù)制過(guò)程中結(jié)合到延長(zhǎng)鏈上的幾率，如果ddNTP濃度高，結(jié)合幾率高，阻礙鏈延長(zhǎng)的幾率就高，那么目的片段復(fù)制的長(zhǎng)度就短。

也就是說(shuō)，這些擴(kuò)增產(chǎn)物具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上。

比如，下圖的復(fù)制過(guò)程中遇到帶尾巴的黃色核苷酸，一共復(fù)制9個(gè)堿基。

凝膠電泳

接下來(lái)，用凝膠電泳把他們分開(kāi)，這里使用的是高分辨率變性丙烯酰胺凝膠，并由四個(gè)泳道組成，每個(gè)泳道對(duì)應(yīng)一種堿基。然后，對(duì)凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

序列讀取

最后通電開(kāi)始跑條帶，在電流與凝膠阻力的作用下，縱向會(huì)出現(xiàn)具有相同間隔有規(guī)律的條帶，它代表著不同的序列長(zhǎng)度，在橫向分別對(duì)應(yīng)ATGC。現(xiàn)在，我們很容易就可以讀出下圖的DNA片段序列為 5’-GATTCGAGCTGA-3’。

現(xiàn)在推斷模板鏈（也就是待測(cè)片段）為 3’-CTAAGCTCGACT-5’

隨著物理及化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們想到可以用相同的激發(fā)波長(zhǎng)且具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)標(biāo)記 ddNTP（用一種激發(fā)光照射后，這些基團(tuán)會(huì)有不同的光學(xué)顏色）。現(xiàn)在，我們就可以把四種 ddNTP 放在同一體系下，通過(guò)光激發(fā)將四種光波長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電腦可識(shí)別的電信號(hào)，在計(jì)算機(jī)眼里就會(huì)表現(xiàn)為不同的物質(zhì)來(lái)處理。

這些新技術(shù)的加入使我們進(jìn)入測(cè)序2.0時(shí)代，商用的二代測(cè)序是目前主流的測(cè)序技術(shù)，它以高度自動(dòng)化測(cè)序儀為載體，實(shí)現(xiàn)了測(cè)序速度的提高，通量的升高，測(cè)序成本的減低，但是同時(shí)也會(huì)降低準(zhǔn)確率。

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