基于Edman降解的蛋白N端序列分析

表達純化后的蛋白產(chǎn)物，特別是蛋白品的分析過程中，需要對蛋白的末端進行驗證，以保證表達純化產(chǎn)物的N端和C端序列準確。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一，有著廣泛的應用。飛凡檢測采用島津公司Edman測序系統(tǒng)，為廣大科研工作者和科研客戶提供純化后蛋白產(chǎn)物、抗體以及蛋白疫苗的N端測序服務。采用我們的測序系統(tǒng)，可以測定N端30個氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上樣系統(tǒng)，可以測定N端的60-70個氨基酸。飛凡檢測也建立了以先進的LC-MS/MS技術(shù)進行N-端測序的平臺，可以測出封閉和修飾的蛋白質(zhì)末端，與Edman降解法形成互補，保證N端測序服務的順利進行。

在蛋白質(zhì)測序前，蛋白樣品首先經(jīng)過SDS-PAGE的分離，保證樣品的純度滿足測序的要求；隨后將SDS-PAGE上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；經(jīng)過染色確定把蛋白條帶并切出；使用Edman測序儀對得到的PVDF膜上的蛋白樣品進行分析。Edman降解測序是通過循環(huán)反應從蛋白質(zhì)的N端開始逐個鑒定氨基酸的種類，從而對蛋白質(zhì)的N端序列進行測定。每一個Edman測序反應包括3步：第一步是在堿性條件下，PITC與蛋白N端的游離氨基結(jié)合；第二步是在酸性溶液中，N端殘基被切除；第三步是PITC結(jié)合的殘基轉(zhuǎn)化成為更為穩(wěn)定的PTH殘基，經(jīng)過在線的HPLC分析，根據(jù)洗脫時間確定氨基酸種類。

基于Edman降解的蛋白質(zhì)N端測序服務流程

應用領(lǐng)域

? 蛋白表達產(chǎn)物的驗證：重組蛋白插入位點和表達順序是否正確；
? 細胞株建立和發(fā)酵過程中蛋白產(chǎn)物的驗證：驗證細胞株建立和發(fā)酵過程中蛋白產(chǎn)物N端甲硫氨酸和信號肽是否正確處理；
? 蛋白降解/酶切分析：對降解/酶切形成的新蛋白片段N端進行分析，確定斷裂/酶切位點；
? De-novo測序：對于蛋白數(shù)據(jù)庫中不存在的全新蛋白序列進行分析。

關(guān)于樣品

PVDF膜類樣品的準備過程

1.樣品電泳和電轉(zhuǎn)
a. 對蛋白樣品進行1D或者2D跑膠
b. 將蛋白膠上的樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；注意：千萬不要使用硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membranes）
c. 在此過程中請佩戴手套和頭套，避免自身角蛋白對測序結(jié)果的影響

2.PVDF膜的染色
a. 染色過程中可以使用考馬斯亮藍或者立春紅對PVDF膜進行染色；注意：千萬不要使用銀染的方法進行染色
b. 染色完成之后，可以使用雙蒸水對PVDF膜進行清洗
c. 如果轉(zhuǎn)膜的緩沖液中含有甘氨酸，需要對PVDF膜進行多次沖洗，以避免甘氨酸對后續(xù)分析的影響
d. 更詳細的樣品準備步驟，見Edman測序樣品準備Protocol

3.靶蛋白條帶獲取
a. PVDF膜染色后，靶條帶清晰可見，用潔凈的解剖刀將靶蛋白條帶切下
b. 在蛋白量允許的情況下，可以準備2-3條靶條帶以增加靶蛋白的量

4.樣品運輸
對切下的蛋白條帶進行密閉包裝，使用冰袋運輸即可

溶液樣品的準備過程

1.蛋白的純度和用量
a. 樣品需要量在1-10 ug
b. 樣品純度要＞90%
c. Buffer中不要使用表面活性劑，并盡可能降低溶液的鹽濃度
d. Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢劑，ammonium sulfate和其他的銨鹽均會對后續(xù)的氨基酸鑒定產(chǎn)生影響，在樣品準備過程中要避免使用
e. 樣品準備過程全程佩戴口罩和頭套，避免角蛋白的影響

2.蛋白樣品的運輸
a. 液體樣品推薦干冰運輸
b. 液體樣品也可以在冷凍抽干或者真空抽干后，使用冰袋運輸

飛凡檢測質(zhì)檢報告流程：

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  1、 提供產(chǎn)品資料

• 2、 工程師根據(jù)您的產(chǎn)品推薦合適檢測項目，并給出報價

• 3、 確認報價沒有問題，然后把樣品送到我們實驗室

• 4、 支付檢測費用，安排檢測

• 5、檢測完成，出具檢測報告，郵寄給客戶

• 咨詢熱線：18018131362

• 關(guān)于飛凡

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飛凡檢測致力于打造國內(nèi)專業(yè)的第三方檢測服務公司，不斷優(yōu)化整合市場檢測資源，飛凡檢測與多家科研院所，如上海同濟大學，蘇州大學，SGS，TUV，以及國內(nèi)眾多知名的檢測公司進行深度合作，共同為國內(nèi)制造業(yè)服務，為中國的制造業(yè)開拓海外市場保駕護航，為我們?nèi)粘Ｉ畹慕】蛋踩珮淞藯U；公司目前工程師百余人，95%以上是本科以上學歷；我們合作的實驗室通過CNAS，CMA（EZ），所出具的任何一張報告都有CNAS，CMA資質(zhì)，確保出具的每份報告都具有權(quán)威的法律效力。

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