體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

飛凡檢測(cè)可依據(jù)GB/T 16886.5進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)試，報(bào)告具有CMA/CNAS資質(zhì)全球認(rèn)可。咨詢熱線：18018131362

        試驗(yàn)步驟：

基本步驟

L929細(xì)胞接種到96孔板上，在培養(yǎng)中保持24小時(shí)(1倍周期) ，直到形成一個(gè)半收斂的單分子層(見(jiàn)參考文獻(xiàn)。[5]了解更多有關(guān)細(xì)胞維持和培養(yǎng)程序的資料)。然后與一系列濃度測(cè)試化合物接觸。暴露24小時(shí)后，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)濃度，并與對(duì)照細(xì)胞比較。每個(gè)試驗(yàn)濃度計(jì)算生長(zhǎng)抑制百分率。

材料:L929細(xì)胞(NCTC克隆929:CCL1 1，美國(guó)類型培養(yǎng)物保藏中心[ATCC]，美國(guó)弗吉尼亞州馬納卡斯)用作細(xì)胞系。ECACC編號(hào)88102702，歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，SP40JG，薩爾茨堡，英國(guó))，并且細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)不含支原體。

準(zhǔn)備：

培養(yǎng)基，

MTT法溶液：MTT溶液進(jìn)行新鮮知識(shí)溶于其中不含酚紅的MEM中，濃度為1mg/ml。溶液可以采用這種注射壓力過(guò)濾器，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾法除菌，溶液宜當(dāng)天我們使用。

樣品提取物的制備: 按 iso 10993-12標(biāo)準(zhǔn)制備樣品提取物

方法：

檢驗(yàn)質(zhì)量檢驗(yàn)1:陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

試驗(yàn)質(zhì)量檢查2：空白

試驗(yàn)步驟：

注意：貯存細(xì)胞進(jìn)行解凍后，細(xì)胞在用于臨床試驗(yàn)研究之前要傳代2次~3次

在凍存細(xì)胞繼代培養(yǎng)后的第一天

酶驅(qū)動(dòng)的消化（trypsin/EDTA）用于從培養(yǎng)瓶中取出培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞懸浮在200克離心3分鐘。       咨詢熱線：18018131362

細(xì)胞密度調(diào)整至1105細(xì)胞/毫升。用多通道移液管在96孔組織培養(yǎng)微板的孔中外側(cè)加入100l 培養(yǎng)基。[附錄 e ]) ，在剩余的孔中中，加入100l 細(xì)胞懸液，密度為1105細(xì)胞/ml (= 1104細(xì)胞/孔)。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)(5% co2,37 ° c，> 90% 濕度)形成半融合單層。在這個(gè)疾病潛伏期期間，細(xì)胞被修復(fù)并附著在指數(shù)增長(zhǎng)上。在相差顯微鏡下檢查每個(gè)平板，確保微滴定板的孔細(xì)胞長(zhǎng)度相等。這個(gè)測(cè)試的目的是確定實(shí)驗(yàn)誤差

第2天

孵育24小時(shí)后，向每個(gè)孔中加入100微升含有適當(dāng)濃度樣品提取物、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照或溶劑(空白)的處理介質(zhì)。試驗(yàn)或陽(yáng)性對(duì)照的浸出液應(yīng)至少有4個(gè)濃度，最高濃度應(yīng)為100%浸出液，其他濃度可在單對(duì)數(shù)區(qū)間范圍內(nèi)適當(dāng)濃縮。陰性對(duì)照應(yīng)僅檢測(cè)100%提取物，培養(yǎng)基應(yīng)作為空白。細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)(5% CO2，37℃，濕度> 90%)

第3天

24h處置后在相差顯微鏡下檢查我們每個(gè)板，判定以及細(xì)胞進(jìn)行接種管理系統(tǒng)設(shè)計(jì)誤差和對(duì)照與試驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境特性。記錄分析試驗(yàn)研究樣品浸提液細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響作用從而導(dǎo)致的細(xì)胞通過(guò)形態(tài)學(xué)處理方面的改變，但這些數(shù)據(jù)記錄不用于其他任何組織細(xì)胞具有毒性定量方法測(cè)定。對(duì)照細(xì)胞的不良社會(huì)生長(zhǎng)發(fā)展特性可表明實(shí)驗(yàn)操作誤差，并且企業(yè)可能會(huì)出現(xiàn)因此沒(méi)有放棄該試驗(yàn)采用平板檢查后小心移除培養(yǎng)基，這是作為一個(gè)非常重要工作步驟，因?yàn)榻嵋褐械幕瘜W(xué)還原劑也會(huì)還原MTT，導(dǎo)致假陰性預(yù)測(cè)結(jié)果。將50μLMTT溶液（見(jiàn)C.2.2.4.3）加到每一試驗(yàn)孔中，平板在37℃培養(yǎng)箱中再孵育2h。然后棄去MTT溶液，每孔加入100滴定板光度計(jì)上測(cè)定吸光度（參照波長(zhǎng)650nm）。A1異丙醇溶液。震蕩平板，置于配置570nm濾光片的微孔

數(shù)據(jù)分析

活細(xì)胞數(shù)減少?gòu)亩鴮?dǎo)致了樣品中代謝功能活性可以降低，這直接與生成的藍(lán)紫色甲臢量有關(guān)，在570nm測(cè)量光密度。按式（C.1）與空白等式問(wèn)題比較分析計(jì)算企業(yè)存活率明顯下降

100×OD存活率(%)

ODs——試驗(yàn)研究樣品100％浸提液光密度分析平均值；

平均OD5空白光密度

當(dāng)存活率低時(shí)，測(cè)試樣品的潛在細(xì)胞毒性高

如果細(xì)胞存活率降低到空白細(xì)胞的70% 以下，則存在潛在的細(xì)胞毒性。試驗(yàn)樣品50% 提取物的成活率應(yīng)至少與100% 提取物相同或更高，否則應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)。

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